ELISA实验样本处理方法

 
 
ELISA 样本的处理 
ELISA 检测的目的是为实验提供准确可靠的定量分析实验依据。为了保证实验数据的可靠
性，在实验过程中必须坚持全面质量控制和全过程质量控制。在收集标本前都必须有一个完整的
计划。 
 
注意事项： 
每个标本量收集体积＝  100ul × 检测种类，如要做复孔，标本量收集体积＝  100ul × 检测
种类×2 。 
对于作某一个具体指标来说，最好先用一系列稀释度作一批标本测定，得出对实验有意义
的一个稀释度（即测定剂量反应曲线），然后用一个最适稀释度测定即可。 
 收集标本前必须清楚要检测的成份是否足够稳定。对收集后当天进行检测的标本，储存在 
4 ℃ 备用，如有特殊原因需要周期收集标本，将标本及时分装后放在  -20 ℃ 或  -70 ℃ 条
件下保存。避免反复冻融。标本  2 -8 ℃ 可保存  48 小时，   -20 ℃ 可保存  1 个月。   -70 度
可保存  6 个月。部分激素类标本需添加抑肽酶。 
血清标本采集时，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，
以 HRP为标记的 ELISA 测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。 
为了保证尿液检测结果的准确性，必须正确收集尿液标本和保存。盛尿容器要清洁干燥。       
最好使用一次性的容器（如塑料尿杯），避免因用药并清洗不干净而造成的污染，影响检
测结果。尿液标本必须新鲜，留取后，应及时检测或保存，以免细菌繁殖。因在室温中久
置后（尤其是夏季）尿中磷酸盐等可析出结晶而干扰检测。 
标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性 HRP，也会产生假阳性反应。
保存过久可发生聚合在 ELISA中可使本底加深。 
冻结标本融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠
倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。 
混浊或有沉淀的标本应先离心或过滤，澄清后再检测。 
反复冻融会使蛋白效价降低，所以待测标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。也可
加入适当防腐剂。 

标本类型 
ELISA常见的标本一般包括： 
液体类标本：包括血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清等。 
培养细胞 
组织标本 
这些标本收集的时间、方法和保存都有一定的要求。 
标本的保存 
一般说来，在 5 天内测定的标本可放置于 4℃，超过一周测定的需低温冻存。 
对收集后当天进行检测的标本，储存在  4 ℃ 备用，如有特殊原因需要周期收集标本， 
将标本及时分装后放在  -20 ℃ 或  -70 ℃ 条件下保存。避免反复冻融。 
标本  2 -8 ℃ 可保存  48 小时，  -20 ℃ 可保存  1 个月。  -70 度可保存  6 个月。部分标
本也可加入适当防腐剂，激素类标本需添加抑肽酶。  
 
标本的处理 
可用作 ELISA 测定的标本十分广泛，体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液）、
细胞培养上清、细胞、组织等均可作标本以测定其中某种成份。有些标本可直接进行测定，有些
则需经预处理。 
血清：   
室温血液自然凝固  10-20 分钟后，离心  20 分钟左右（  2000-3000 转  / 分）。收集上清。如
有沉淀形成，应再次离心。   
血浆：   
应根据试剂盒的要求选择  EDTA 、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，加入  10 ％（  v/v ）抗凝剂 
( 0.1M 柠檬酸钠或  1% heparin 或  2.0%EDTA.Na2) 混合  10-20 分钟后，离心  20 分钟左右
（  2000-3000 转  / 分）。仔细收集上清。如有沉淀形 成，应再次离心。   
尿液、胸腹水、脑脊液：   
用无菌管收集。离心  20 分钟左右（  2000-3000 转  / 分）。仔细收集上清。如有沉淀形成，
应再次离心。   
 细胞培养上清：   
检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心  20 分钟左右（  2000-3000 转  / 分）。仔细收集
上清。检测细胞内的 成份时，用  PBS （  PH7.2-7.4 ）稀释细胞悬液，细胞浓度达到  100 万 
/ml 左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心  20 分钟左右（  2000-3000 转 
/ 分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。   
细胞： 
检测细胞的成份时，对于贴壁细胞，去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加
入适量裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞10 秒后，细胞
就会被裂解。对于悬浮细胞，离心收集细胞，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍.加入适
量裂解液, 用枪吹打把细胞吹散。用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉
淀。如果细胞量较多，必需分装然后再裂解。充分裂解后，10000-14000g离心3-5 分钟，取上
清，即可进行后续操作。 
组织标本：   
切割标本后，称取重量。加入一定量的  PBS或组织蛋白萃取试剂，缓冲液中可加入蛋白酶抑制
剂。用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心  20 分钟左右（  2000-3000 转  / 分）。仔细收集
上清置于  -20 度或  - 70 度保存，如有必要，可以将样品浓缩干燥。分装后一份待检测，其余
冷冻备用。